1ª PRÁCTICA

13/12/19
PRÁCTICA Nº1: "PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE COCOS GRAM NEGATIVOS"

MATERIAL NECESARIO

• Agua destilada.
• Probeta de 100 mL.
• Balanza electrónica.
• Espátula y vidrio de reloj.
• Embudo.
• Matraz Erlenmeyer de 300 mL.
• Pipetas Pasteur.
• Varilla agitadora.
• Pipeta automática de 1000-5000 microlitros y puntas de 5000 microlitros.
• Vaso de precipitados.
• Microondas.
• Papel de filtro.
• Tijeras.
• Portaobjetos.
• Asas de siembra estériles desechables.
• Tubo de ensayo de 3 mL.
• Pinzas metálicas.
• Mechero Bunsen.
• Solución Salina Fisiológica (SSF).
• Pipeta automática de 100-1000 microlitros y puntas azules.
• Estufa.
• Bote de orina ("contenedor de desechos").

REACTIVOS

• Caldo base al rojo Fenol.
• Glucosa.
• Reactivo de Kovacs (Tetrametil-p-fenilen diamina).
• Discos de ONPG.

1º) PREPARACIÓN DEL CALDO BASE DE ROJO FENOL

1. Depositar 100 mL de agua destilada en una probeta de 100 mL (enrasar con pipeta Pasteur).
   
2. Echar un poco de los 100 mL de agua destilada sobre un matraz Erlenmeyer de 300 mL con ayuda de un embudo.
3. Medir 1'5 gramos de Rojo Fenol en una balanza electrónica.
   
   
   
   
4. Depositar los 1'5 gramos previamente medidos al matraz Erlenmeyer de 300 mL.
   
5. Mezclar la solución con una varilla agitadora.
6. Echar el resto de los 100 mL de agua destilada medida en la probeta al matraz Erlenmeyer.
   

2º) PREPARACIÓN DE GLUCOSA AL 2%.

1. Con un pipeta de 1000-5000 microlitros, depositar 5000 microlitros de agua destilada en un vaso de precipitados. Realizar la operación 2 veces, ya que necesitamos 10 mL (10.000 microlitros) de agua destilada.
   
2. Medir en la balanza electrónica 0'2 gramos de glucosa.
   
   
   
   
3. Echar los 0'2 gramos de glucosa en el vaso de precipitados.
4. Mezclar con una varilla agitadora.
5. Verter los 10 mL agua destilada + 0'2 gramos de glucosa en el matraz Erlenmeyer de 300 mL donde se encuentran los 100 mL de agua destilada + 1'5 gramos de Rojo Fenol.
   
6. Calentar en el microondas el matraz Erlenmeyer.
   
7. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

3º) PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS
A) OXIDASA CON PSEUDOMONAS
- FUNDAMENTO: Se basa en la capacidad que tienen algunos microorganismos aerobios o anaerobios facultativos de producir la enzima "citocromo oxidasa" que cataliza, en la cadena respiratoria, la transferencia de electrones desde un sustrato orgánico hasta el oxígeno.
- INTERÉS: Diferenciar los géneros Neisseria, Branhamella y Moraxella oxidasa (+), del género Acinetobacter (oxidasa -).
- TÉCNICA:

1. Colocar un trozo de papel de filtro (previamente recortado con unas tijeras) en un portaobjetos.
   
2. Añadir 2-3 gotas del reactivo de Kovacs (Tetrametil-p-fenilen diamina) en el centro del papel. Este reactivo, se oxida en presencia del enzima transformándose en un producto coloreado. 
   
   
   
   
3. Extender una colonia de Pseudomonas, con el asa de siembra estéril, sobre el papel impregnado con el reactivo.
   
   
   
   
   
   
   
4. El resultado es positivo si observamos aparición de color violeta a los 5-10 segundos.
   
   
   
   

B) BETA GALACTOSIDASA (ONGP) CON ENTEROBACTER
- FUNDAMENTO: Determina la capacidad de algunas bacterias, que poseen el enzima Beta-galactosidasa, para fermentar la lactosa originando glucosa y galactosa.
Para realizar la prueba, se añade un sustrato artificial, ONPG (ortonitrofenil galactósido), que al ser hidrolizado por la Beta-galactosidasa origina un compuesto (orto-nitrofenol) de color amarillo.
- INTERÉS: Diferenciar la Neisseria lactámica de otras especies de Neisseria.
Diferenciar Enterobacterias: Que dan positiva la prueba (E.Coli, Klebsiella, Aerobacter y Enterobacter) y que dan negativa la prueba (Proteus, Salmonella, Shigella y Pseudomonas).
- TÉCNICA:

1. Depositar en un tubo de ensayo de 3 mL, un disco de ONPG. Para ello, flamear unas pinzas metálicas en el mechero Bunsen, coger el disco y depositarlo en el tubo de ensayo; volver a flamear las pinzas metálicas para guardarlas.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
2. Recortar la parte superior del bote de Solución Salina Fisiológica (SSF) con unas tijeras y con una pipeta automática de 100-1000 microlitros, dispensar 1 mL de SSF en el tubo de ensayo de 3 mL donde se encuentra el disco de ONPG.
   
   
   
   
3. Coger una colonia de Enterobacter con un asa de siembra estéril y sembrarla en el tubo con SSF y disco de ONPG en picadura.
   
   
   
   
   
   
   
4. Incubar a 37ºC durante 24 horas.

- RESULTADOS:
Prueba positiva: Color amarillo debido a la presencia de Beta-Galactosidasa.
Prueba negativa: No hay cambio de color (no hay Beta-Galactosidasa).

C) FERMENTACIÓN DE AZÚCARES CON KLEBSIELLA
- FUNDAMENTO: Las bacterias anaerobias y anaerobias facultativas, con frecuencia, fermentan los carbohidratos produciendo ácidos orgánicos y gas que se detectan mediante un indicador de pH y una campana Durham.
- TÉCNICA:

1. Depositar en un tubo de ensayo de vidrio y tapón de rosca, 5 mL (=5000 microlitros) de Rojo Fenol (preparado en matraz Erlenmeyer de 300 mL) con ayuda de la pipeta de 1000-5000 microlitros y punta de pipeta de 5000 microlitros.
   
   
   
   
   
   
   
2. Inocular la bacteria (Klebsiella) en el medio líquido que contiene una pequeña cantidad de peptona (agua de peptona), un indicador de pH (rojo de fenol) y una fuente de carbono fermentable (glucosa) al 2%.
   
   
   
   
   
   
   
3. Introducir en el medio una campana Durham para comprobar si el microorganismo produce gas o no.
   
   
   
   
4. Incubar a 37ºC durante 24 horas.

- RESULTADOS:
Tras 24 horas de incubación, observamos los tubos:
RESULTADO POSITIVO: La producción de ácido vira el medio del color rojo al amarillo.
En el caso de que forme gas el microorganismo, dentro de la campana de Durhan se observa una zona de aire. Si se produce fermentación pueden observarse 2 casos:
- Que no se forme gas dentro de la campana Durham.
- Que se forme gas dentro de la campana Durham.
RESULTADO NEGATIVO: No fermenta carbohidratos (no cambia de color, no produce gas).