2ª PRÁCTICA
10/01/2020
PRÁCTICA Nº2: "PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA BACILOS GRAM NEGATIVOS"
MATERIAL NECESARIO
1º) KLIGLER
- FUNDAMENTO:
Es un medio sólido de cultivo utilizado para la diferenciación de Enterobacterias en base a la fermentación de lactosa y glucosa, además de la formación de ácido sulfhídrico.
Se prepara en un tubo inclinado y contiene lactosa, glucosa, peptona y un indicador de pH (rojo fenol) que vira a amarillo cuando el pH es ácido y que toma un color rojo más intenso (rojo cereza) cuando el pH es alcalino.
La fermentación o utilización de los hidratos de carbono se produce tanto en condiciones anaerobias (fondo del tubo) como en condiciones aerobias (superficie inclinada), siguiendo varias rutas metabólicas.
LA FERMENTACIÓN Y UTILIZACIÓN DE GLUCOSA Y LACTOSA:
- Fermentación de glucosa: Como la concentración de glucosa es baja, su fermentación afecta sólo al fondo del tubo (condiciones poco aerobias), que vira a color amarillo. Cuando la glucosa se agota (al cabo de 18-24 horas), el microorganismo comienza a utilizar las peptonas del medio, que al liberar amonio, producen un pH alcalino, que hace virar al medio hacia una coloración roja más intensa (rojo cereza) en la superficie inclinada del tubo.
- Fermentación de glucosa y lactosa: Algunos microorganismos pueden fermentar ambos hidratos de carbono y como la concentración de lactosa, en el medio, es diez veces mayor que la concentración de glucosa, no se agota al cabo de 18-24 horas, manteniéndose el pH ácido tanto en el fondo del tubo (amarillo) como en la superficie inclinada (rojo cereza).
Cuando se produce un cambio de color (rojo cereza) en la superficie inclinada del tubo (reacción alcalina) y no hay cambio de color en el fondo del tubo, indica que el microorganismo metaboliza las peptonas únicamente en condiciones aerobias.
Por el contrario, cuando el microorganismo es capaz de utilizar las peptonas tanto en condiciones aerobias como anaerobias, se produce la alcalinidad tanto en la superficie inclinada (rojo cereza) como en el fondo del tubo (rojo cereza).
- Producción de gas: En los tubos de Kligler no sólo se observa la fermentación de la lactosa y la glucosa, sino también la producción de gas (CO2 y O2) como producto final del metabolismo de los carbohidratos. La producción de gas se pone de manifiesto por la aparición de burbujas, grietas en el medio, desplazamiento del fondo del tubo, etc.
- Producción de ácido sulfhídrico: El ácido sulfhídrico generado reacciona con el hierro que contiene el medio (en forma de sales de hierro) formando sulfuro de hierro, insoluble y de color negro.
- TÉCNICA:
- RESULTADOS:
Se expresa la glucosa en primer lugar, indicando si forma gas, a continuación se expresa la lactosa y por último el ácido sulfhídrico.
Citrobacter: +/+/+
Fermenta la glucosa y la lactosa (medio entero amarillo), produce gas (desplazamiento del medio) y produce ácido sulfhídrico (zona ennegrecida).
La interpretación debería haber sido a las 24 horas +/-/+/- y a las 48 horas +/-/+/+, pero al cabo de 72 horas el resultado ha sido +/+/+/+.
2º) IMVIC
- FUNDAMENTO:
Es un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas para la identificación bacteriana: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato.
A) INDOL
- FUNDAMENTO:
Identificación de bacterias que producen el enzima triptonasa y por tanto son capaces de producir indol a partir del aminoácido triptófano (presente en el medio).
El indol se visualiza con el reactivo de Kovacs, que provoca la formación de un anillo rojo en el tubo,
- TÉCNICA:
- RESULTADO:
La interpretación del resultado se ha realizado a las 72 horas y ha sido negativo (anillo amarillo).
- FUNDAMENTO:
La prueba del rojo de metilo estudia la capacidad de las bacterias para metabolizar la glucosa por la vía de la fermentación ácido-mixta, en la cual se producen ácidos estables que bajan el pH del medio. Este descenso se puede detectar a través de un indicador de pH añadido al medio (Rojo de metilo).
- TÉCNICA:
- RESULTADOS:
La prueba es positiva cuando se desarrolla un color rojo estable.
La prueba es negativa cuando aparece un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo.
El resultado se ha interpretado a las 72 horas y ha sido negativo.
C) VOGES-PROSKAUER (VP)
- FUNDAMENTO:
Se utiliza para identificar a las Enterobacterias.
Estudia la capacidad de las bacterias para metabolizar la glucosa por la vía de la fermentación butilen glicólica (o butanodiólica), en la cual se forma acetoina (acetilmetilcarbinol), que es un producto intermediario en la producción de butanodiol.
La acetoina puede ser detectada añadiendo, al medio, alfa-naftol y KOH al 40% que reaccionarán produciendo un color rojo característico.
- TÉCNICA:
- RESULTADOS:
La prueba es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia, que indica la presencia de diacetilo (producto de oxidación de la acetoína).
La interpretación del resultado se ha realizado a las 72 horas y ha sido negativo.
D) CITRATO
- FUNDAMENTO:
Esta prueba determina la capacidad que tienen algunos microorganismos para usar el citrato como única fuente de carbono. Esta reacción es llevada a cabo por la enzima citrasa.
El citrato se produce en el ciclo de Krebs, pero algunos organismos son capaces de usarlo como única fuente de carbono, cuando no hay carbohidratos fermentables en el medio.
El medio inicialmente es de color verde pero cuando el microorganismo utiliza el citrato se forman productos alcalinos que aumentan el pH del medio (> pH 7,6) causando el viraje del indicador (azul de bromotimol) contenido en el medio que pasa de verde a azul.
- TÉCNICA:
- RESULTADOS:
La prueba es positiva cuando se produce un cambio de color de verde a azul.
La ausencia de cambio de color (verde) se considera un resultado negativo.
La interpretación del resultado se ha realizado a las 72 horas y ha sido negativo.
3º) TEST DE LA UREA
- FUNDAMENTO:
Esta prueba se utiliza para diferenciar a los microorganismos capaces de hidrolizar la urea por la acción del enzima ureasa, que al hidrolizar la urea, origina amoníaco, el cual produce un incremento del pH del medio que puede detectarse mediante un indicador (Rojo Fenol).
Se puede utilizar un medio sólido en slant, como puede ser el Agar urea de Christensen o un medio líquido como el Caldo urea indol.
- TÉCNICA:
- RESULTADOS:
Resultado positivo: El medio vira a color rosa (indica hidrólisis de la urea).
Resultado negativo: En el medio no se observa cambio de color (no hay hidrólisis de urea).
La interpretación del resultado se ha realizado a las 72 horas y los medios no han presentado ningún cambio.
RESULTADOS:
PRUEBA DE LA OXIDASA
- PROCEDIMIENTO:
El resultado de la oxidasa ha sido negativo con Citrobacter, pues no se ha observado la aparición de color violeta a los 5-10 segundos.
Mientras que los compañeros que han inoculado Pseudomonas, el resultado ha sido positivo:
GALERÍA DEL SISTEMA API 20E
- FUNDAMENTO:
Es un sistema estandarizado que permite la identificación de Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram negativos no exigentes, que incluye 21 test bioquímicos miniaturizados, así como una base de datos. La lista completa de las bacterias posibles de identificar con este sistema se presenta en la Tabla de Identificación al final de la presente ficha técnica.
Se compone de 20 microtubos que contienen los substratos deshidratados. Los microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana que reconstituye los tests. Las reacciones producidas durante el periodo de incubación se traducen en cambios de color espontáneos o revelados mediante la adición de reactivos.
La lectura de estas reacciones se lleva a cabo utilizando la Tabla de Lectura, y la identificación se obtiene con la ayuda del Catálogo Analítico o del software de identificación.
- TÉCNICA:
La interpretación se ha realizado a las 72 horas.
Al microtubo de la "Fenilalanina APP (TDA)", añadir una gota de FeCl3 10%.
Al microtubo del "Voges-Proskauer (VP)" añadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2H5OH).
Al microtubo del "Indol (IND)", añadir una gota del reactivo de James.
PRÁCTICA Nº2: "PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA BACILOS GRAM NEGATIVOS"
MATERIAL NECESARIO
- Gradilla.
- Mechero Bunsen y encendedor.
- Asas de siembra estériles desechables.
- 7 tubos de medios de cultivo diferentes:
- 1 tubo "KIGLER IRON AGAR".
- 1 tubo de "BUFFERED PEPTONE WATER".
- 2 tubos de "METHYL RED VOGES-PROSKAUER".
- 1 tubo de "SIMMONS CITRATE AGAR".
- 1 tubo de "UREA INDOLE BROTH".
- 1 tubo de "UREA AGAR".
- Microorganismo: "CITROBACTER".
- Reactivo de Kovacs (prueba oxidasa).
- Portaobjetos.
- Papel de filtro.
- Galería API 20E.
- Bote de SSF de 5 mL.
- Pipetas Pasteur.
- Estufa.
1º) KLIGLER
- FUNDAMENTO:
Es un medio sólido de cultivo utilizado para la diferenciación de Enterobacterias en base a la fermentación de lactosa y glucosa, además de la formación de ácido sulfhídrico.
Se prepara en un tubo inclinado y contiene lactosa, glucosa, peptona y un indicador de pH (rojo fenol) que vira a amarillo cuando el pH es ácido y que toma un color rojo más intenso (rojo cereza) cuando el pH es alcalino.
La fermentación o utilización de los hidratos de carbono se produce tanto en condiciones anaerobias (fondo del tubo) como en condiciones aerobias (superficie inclinada), siguiendo varias rutas metabólicas.
LA FERMENTACIÓN Y UTILIZACIÓN DE GLUCOSA Y LACTOSA:
- Fermentación de glucosa: Como la concentración de glucosa es baja, su fermentación afecta sólo al fondo del tubo (condiciones poco aerobias), que vira a color amarillo. Cuando la glucosa se agota (al cabo de 18-24 horas), el microorganismo comienza a utilizar las peptonas del medio, que al liberar amonio, producen un pH alcalino, que hace virar al medio hacia una coloración roja más intensa (rojo cereza) en la superficie inclinada del tubo.
- Fermentación de glucosa y lactosa: Algunos microorganismos pueden fermentar ambos hidratos de carbono y como la concentración de lactosa, en el medio, es diez veces mayor que la concentración de glucosa, no se agota al cabo de 18-24 horas, manteniéndose el pH ácido tanto en el fondo del tubo (amarillo) como en la superficie inclinada (rojo cereza).
Cuando se produce un cambio de color (rojo cereza) en la superficie inclinada del tubo (reacción alcalina) y no hay cambio de color en el fondo del tubo, indica que el microorganismo metaboliza las peptonas únicamente en condiciones aerobias.
Por el contrario, cuando el microorganismo es capaz de utilizar las peptonas tanto en condiciones aerobias como anaerobias, se produce la alcalinidad tanto en la superficie inclinada (rojo cereza) como en el fondo del tubo (rojo cereza).
- Producción de gas: En los tubos de Kligler no sólo se observa la fermentación de la lactosa y la glucosa, sino también la producción de gas (CO2 y O2) como producto final del metabolismo de los carbohidratos. La producción de gas se pone de manifiesto por la aparición de burbujas, grietas en el medio, desplazamiento del fondo del tubo, etc.
- Producción de ácido sulfhídrico: El ácido sulfhídrico generado reacciona con el hierro que contiene el medio (en forma de sales de hierro) formando sulfuro de hierro, insoluble y de color negro.
- TÉCNICA:
- Con un asa de siembra estéril desechable, tomamos una colonia del microorganismo (Citrobacter).
- Sembrar el microorganismo en picadura en el fondo del tubo.
- A continuación, sembrar en estría sobre la superficie del pico de flauta.
- Incubar a 37ºC durante 24 horas.
- RESULTADOS:
Se expresa la glucosa en primer lugar, indicando si forma gas, a continuación se expresa la lactosa y por último el ácido sulfhídrico.
Citrobacter: +/+/+
Fermenta la glucosa y la lactosa (medio entero amarillo), produce gas (desplazamiento del medio) y produce ácido sulfhídrico (zona ennegrecida).
La interpretación debería haber sido a las 24 horas +/-/+/- y a las 48 horas +/-/+/+, pero al cabo de 72 horas el resultado ha sido +/+/+/+.
2º) IMVIC
- FUNDAMENTO:
Es un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas para la identificación bacteriana: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato.
A) INDOL
- FUNDAMENTO:
Identificación de bacterias que producen el enzima triptonasa y por tanto son capaces de producir indol a partir del aminoácido triptófano (presente en el medio).
El indol se visualiza con el reactivo de Kovacs, que provoca la formación de un anillo rojo en el tubo,
- TÉCNICA:
- En un tubo con caldo de peptona, se inocula una colonia de Citrobacter.
- Se incuba a 37ºC durante 24-48 horas.
- Transcurrido este tiempo, añadimos varias gotas del reactivo de Kovacs que al ser menos denso que el caldo de peptona, queda sobre la superficie de éste formando una especie de anillo, que puede ser: Color rojo - morado (positivo) y color amarillo (negativo).
- RESULTADO:
La interpretación del resultado se ha realizado a las 72 horas y ha sido negativo (anillo amarillo).
- FUNDAMENTO:
La prueba del rojo de metilo estudia la capacidad de las bacterias para metabolizar la glucosa por la vía de la fermentación ácido-mixta, en la cual se producen ácidos estables que bajan el pH del medio. Este descenso se puede detectar a través de un indicador de pH añadido al medio (Rojo de metilo).
- TÉCNICA:
- En el medio líquido de Clark-Lubs, inoculamos unas colonias aisladas de Citrobacter.
- Incubar a 37ºC durante 24-48 horas.
- Transcurrido este tiempo, añadimos unas cuantas gotas de solución alcohólica de rojo de metilo y observamos el resultado.
- RESULTADOS:
La prueba es positiva cuando se desarrolla un color rojo estable.
La prueba es negativa cuando aparece un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo.
El resultado se ha interpretado a las 72 horas y ha sido negativo.
C) VOGES-PROSKAUER (VP)
- FUNDAMENTO:
Se utiliza para identificar a las Enterobacterias.
Estudia la capacidad de las bacterias para metabolizar la glucosa por la vía de la fermentación butilen glicólica (o butanodiólica), en la cual se forma acetoina (acetilmetilcarbinol), que es un producto intermediario en la producción de butanodiol.
La acetoina puede ser detectada añadiendo, al medio, alfa-naftol y KOH al 40% que reaccionarán produciendo un color rojo característico.
- TÉCNICA:
- En un medio líquido Clark-Lubs, inoculamos una colonia de Citrobacter.
- Incubar a 37ºC durante 24-48 horas.
- Transcurrido este tiempo, añadir unas gotas de solución de alfa-naftol, agitar y añadir KOH al 40% y observar el resultado a los 15 minutos.
- RESULTADOS:
La prueba es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia, que indica la presencia de diacetilo (producto de oxidación de la acetoína).
La interpretación del resultado se ha realizado a las 72 horas y ha sido negativo.
D) CITRATO
- FUNDAMENTO:
Esta prueba determina la capacidad que tienen algunos microorganismos para usar el citrato como única fuente de carbono. Esta reacción es llevada a cabo por la enzima citrasa.
El citrato se produce en el ciclo de Krebs, pero algunos organismos son capaces de usarlo como única fuente de carbono, cuando no hay carbohidratos fermentables en el medio.
El medio inicialmente es de color verde pero cuando el microorganismo utiliza el citrato se forman productos alcalinos que aumentan el pH del medio (> pH 7,6) causando el viraje del indicador (azul de bromotimol) contenido en el medio que pasa de verde a azul.
- TÉCNICA:
- En un medio líquido de "Agar citrato de Simmons", sembramos unas colonias de Citrobacter en la superficie inclinada del medio.
- Incubar a 37ºC durante 24 horas.
- RESULTADOS:
La prueba es positiva cuando se produce un cambio de color de verde a azul.
La ausencia de cambio de color (verde) se considera un resultado negativo.
La interpretación del resultado se ha realizado a las 72 horas y ha sido negativo.
3º) TEST DE LA UREA
- FUNDAMENTO:
Esta prueba se utiliza para diferenciar a los microorganismos capaces de hidrolizar la urea por la acción del enzima ureasa, que al hidrolizar la urea, origina amoníaco, el cual produce un incremento del pH del medio que puede detectarse mediante un indicador (Rojo Fenol).
Se puede utilizar un medio sólido en slant, como puede ser el Agar urea de Christensen o un medio líquido como el Caldo urea indol.
- TÉCNICA:
- En el Caldo urea indol, inoculamos unas colonias de Citrobacter.
- Hacer lo mismo en el "Agar urea" (medio sólido en slant). Inocular unas colonias de Citrobacter sobre la superficie del pico de flauta.
- Incubar a 37ºC durante 24 horas.
- RESULTADOS:
Resultado positivo: El medio vira a color rosa (indica hidrólisis de la urea).
Resultado negativo: En el medio no se observa cambio de color (no hay hidrólisis de urea).
La interpretación del resultado se ha realizado a las 72 horas y los medios no han presentado ningún cambio.
RESULTADOS:
PRUEBA DE LA OXIDASA
- PROCEDIMIENTO:
- Colocar un trozo de papel de filtro en un portaobjetos.
- Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
- Extender una colonia de Citrobacter con el asa de siembra estéril desechable sobre el papel impregnado con el reactivo.
El resultado de la oxidasa ha sido negativo con Citrobacter, pues no se ha observado la aparición de color violeta a los 5-10 segundos.
Mientras que los compañeros que han inoculado Pseudomonas, el resultado ha sido positivo:
GALERÍA DEL SISTEMA API 20E
- FUNDAMENTO:
Es un sistema estandarizado que permite la identificación de Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram negativos no exigentes, que incluye 21 test bioquímicos miniaturizados, así como una base de datos. La lista completa de las bacterias posibles de identificar con este sistema se presenta en la Tabla de Identificación al final de la presente ficha técnica.
Se compone de 20 microtubos que contienen los substratos deshidratados. Los microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana que reconstituye los tests. Las reacciones producidas durante el periodo de incubación se traducen en cambios de color espontáneos o revelados mediante la adición de reactivos.
La lectura de estas reacciones se lleva a cabo utilizando la Tabla de Lectura, y la identificación se obtiene con la ayuda del Catálogo Analítico o del software de identificación.
- TÉCNICA:
- Tomamos unas colonias de Citrobacter con un asa de siembra estéril desechable y las introducimos en un bote de 5 mL de Solución Salina Fisiológica (SSF).
- Con una pipeta Pasteur, introducir la suspensión previamente preparada en cada uno de los microtubos de la galería según las indicaciones de llenado que nos proporciona la galería.
- En caso de que las iniciales de las pruebas inscritas en la galería no lleven ninguna línea, llenar el microtubo sólo con la suspensión bacteriana.
- Las iniciales que presentan una línea en la parte inferior, llenar el microtubo con la suspensión bacteriana y la cúpula con aceite de parafina para crear una atmósfera anaerobia.
- Aquellas iniciales que se presentan dentro de un cuadrado (menos la parte superior), llenar el microtubo y la cúpula con la suspensión bacteriana.
Nota: Para evitar la formación de burbujas de aire al llenar los tubos, dejar resbalar la suspensión por la pared del tubo.
- Poner agua destilada alternativamente en los alvéolos de su propia cámara húmeda de incubación para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación.
- Colocar la tira de API20E encima, tapar la cámara y situarla en estufa a 37ºC durante 18-24 horas.
La interpretación se ha realizado a las 72 horas.
Al microtubo de la "Fenilalanina APP (TDA)", añadir una gota de FeCl3 10%.
Al microtubo del "Voges-Proskauer (VP)" añadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2H5OH).
Al microtubo del "Indol (IND)", añadir una gota del reactivo de James.
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