5ª PRÁCTICA

28/01/2020
PRÁCTICA Nº5: "COPROCULTIVO"

FUNDAMENTO
Microorganismos como protozoos, bacterias y virus pueden ser responsables de cuadros gastrointestinales caracterizados por diarrea, que a veces se acompaña de vómitos, dolor abdominal y fiebre. Ante la sospecha de gastroenteritis bacteriana es necesario realizar un cultivo de heces o COPROCULTIVO que permita aislar e identificar el microorganismo responsable del proceso diarreico.
Consiste en el cultivo de materia fecal. Es un método de diagnóstico microbiológico que permite identificar diferentes organismos causantes de enfermedades gastrointestinales.
Es indicado para el diagnóstico de ciertas infecciones del aparato gastrointestinal, especialmente aquellas infecciones provocadas por bacterias. Se utiliza para estudiar casos de diarrea severa, persistente o recurrente sin causas conocidas, y en caso de diarreas asociadas al consumo de antibióticos.
Los medios de cultivo más utilizados son:

• Agar S-S: Selectivo para Salmonella y Shigella.
• Agar sangre o Agar sangre + ácido nalidixico: Para Streptococcus.
• Agar Hektoen: Para Salmonella y Shigella.
• Agar Yersinia (CIN): Para Yersinia.
• Agar Skirrow: Campylobacter.
• Medio de Chapman: Si se observan Estafilococos.
• Agar Sabouraud con cloramfenicol: Para Candida.
• XLD (xilosa-lisina-desoxicolato): Selectivo para Salmonella y Shigella.
• TCBS: Para Vibrio cholerae.

MATERIAL NECESARIO

• Mechero Bunsen.
• Encendedor.
• Gradilla.
• Asas de siembra estériles desechables.
• Hisopos.
• Inóculo de Klebsiella y Proteus.
• Medios sólidos en placa: A-S, S-S, XLD, HK, EMB, MCK.
• Medio líquido en tubo: Caldo Selenito.
  

PROCEDIMIENTO

1. Antes de proceder a la realización de la práctica, hemos realizado inóculos. En mi caso, he sembrado en un bote de Solución Salina Fisiológica de 5 mL, Serratia y Proteus. Posteriormente, tapar el bote con papel Parafilm e incubar en estufa unos 10-15 minutos.
   Nota: Hemos sustituido la muestra de heces por los inóculos.
   
2. En primer lugar, hemos calentado el medio "HEKTOEN ENTERIC" en el microondas y lo hemos depositado en placas de Petri estériles para preparar el medio.
   
3. Posteriomente, hemos hecho lo mismo para el medio "SALMONELLA SHIGELLA AGAR".
   
   
   
4. Una vez preparados los medios, realizar grupos de 3 personas y proceder a la realización de la práctica:
1. Introducir un hisopo estéril en el inóculo (Klebsiella y Proteus) y sembrar con éste en la placa de Agar Sangre realizando una estría desde el borde superior de la placa hasta la mitad.
   
   
   
   
   
2. A continuación, con un asa de siembra estéril de punta redonda, se siembra por agotamiento de estrías en el resto de la placa.
3. Posteriormente, realizar el mismo procedimiento con el medio Salmonella-Shigella, XLD, Hektoen, EMB y Mc.Conkey.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
4. Por último, recortar la parte superior del hisopo e introducirlo en caldo selenito (enriquecimiento de Salmonella). Agitar un poco el hisopo en el caldo y tapar el tubo con el tapón de rosca.
   
   
   
5. Incubar las placas y el caldo selenito en estufa a 37ºC durante 24 horas.

30/01/2020
RESULTADOS
A los dos días, leer los resultados del coprocultivo.

• En Agar SS, el Proteus debería formar colonias incoloras no fermentadoras de lactosa (-) con centro negro.
  
• Hektoen: Colonias azul vedosas, no fermentadoras de lactosa (-) con centro negro.
  
• XLD: Colonias de color amarillo con centro negro. 
  

• Agar Sangre contaminado:
  

• Agar Mc.Conkey (colonias incoloras) y EMB (colonias negruzcas sin virar de color el medio): 
  
  
  
  

Una vez leídos los resultados, hacer una resiembra del caldo selenito en Agar Hektoen, de manera que con el hisopo del caldo, realicemos una descarga hasta la mitad de la placa con una línea vertical desde el borde superior de ésta, a continuación realizar una siembra en masa a ambos lados de la línea vertical y por último arrastrar colonias hacia ambos lados inferiores de la placa para aislamiento.

GALERÍA API 10 S
FUNDAMENTO
Es un sistema estandarizado que permite la identificación de Enterobacteriaceae y otros Gram negativos no exigentes, que incluye 10 test bioquímicos miniaturizados, así como una base de datos. La lista completa de las bacterias posibles de identificar con este sistema se presenta en la Tabla de Identificación al final de la presente ficha técnica.
Se compone de 10 microtubos que contiene los substratos deshidratados. Los microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana que reconstituye los tests. Las reacciones producidas durante el periodo de incubación se traducen en cambios de color espontáneos o revelados mediante la adición de reactivos.
La lectura de estas reacciones se lleva a cabo utilizando la Tabla de Lectura, y la identificación se obtiene con la ayuda del Catálogo Analítico o del software de identificación.

PROCEDIMIENTO

1. Realizar dos inóculos. Sembrar en en un tubo de 5 mL de Solución Salina Fisiológica (SSF) los microorganismos del medio XLD y en otro tubo de SSF los microorganismos del medio Hektoen.
   
   
   
2. Tapar los tubos con papel Parafilm e incubar en estufa durante 10 minutos a 37ºC.
3. Una vez incubados los botes de SSF con los microorganismos, realizar una galería API 10S con el inóculo del medio XLD y otra galería API 10S con el inóculo del medio Hektoen. Para ello, depositar en cada galería la suspensión bacteriana correspondiente con ayuda de pipetas Pasteur y siguiendo las instrucciones de llenado (son las mismas que las de la galería API 20E explicadas en prácticas anteriores).
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
4. Poner agua destilada alternativamente en los alveolos de la cámara húmeda, colocar la galería encima y tapar con la tapadera. Hacer el mismo procedimiento con las dos galerías (cada una presenta su propia cámara de incubación). 
   
5. Incubar en estufa ambas galerías en sus correspondientes cámaras húmedas a 37ºC durante 24 horas.

RESULTADOS (31/01/2020)

• Depositar los reveladores que se requieran en cada microtubo y proceder a la lectura:
  
• Reactivo de TDA en el microtubo de TDA.
  
  
  
• Reactivo de James en el microtubo "IND".
  
• Nitrito 1 y nitrito 2 en el microtubo "GLU". 
  

Antes de los reveladores:

Después de depositar los reveladores e identificación del microorganismo:

• Uno corresponde a Proteus y el otro no se encontraba en el Manual de Identificación.

 RESULTADO PLACA HEKTOEN DE LA RESIEMBRA DEL CALDO SELENITO:

• Colonias verdosas no fermentadoras de lactosa con centro negro (Salmonella).